ВАСИЛЬЕВА Е.М., кандидат биологических наук
МАТКОВСКАЯ Т.А., кандидат химических наук
ЗУБКОВА И.В.
БАКАНОВ М.И., доктор медицинских наук
ЛОЗОВСКАЯ Л. С., доктор медицинских наук

Вирусы и их токсины оказывают повреждающее действие на центральную нервную систему. Поражение нервных клеток при вирусной инфекции может быть следствием не только репродукции вируса, но и результатом развития иммунопатологических реакций на поверхности клетки [2, 4, 8]. Имеется прямая зависимость между степенью повреждения клеточных мембран и тяжестью болезни. Полагают, что вирусная инфекция является пусковым механизмом патологического процесса [2]. Известно, что клетка может поражаться вирусом, даже если у нее нет комплементарных с ним рецепторов (например, вирусы полиомиелита, Коксаки) [1].

В последнее время особую актуальность приобрела проблема поиска противовирусных препаратов. Например, при миксовирусных и парамиксовирусных инфекциях эффективны амантадин, гуанидин, а также антибиотики актиномицин Д, пуромицин и др. [1]. Но антибиотики сами являются токсичными веществами. При моделировании на животных хронической формы Коксаки инфекции и поиске эффективных средств борьбы с ней нами было установлено противовирусное действие фосфонуксусной кислоты [7]. Существуют данные, что такие вещества, как азидотимидин, 2,3- дидезоксинуклеозиды и фосфонформиат, нарушают обратную транскрипцию онковирусов и вирусов иммунодефицита человека [2].

Важнейшими факторами, часто приводящими к гибели клетки, являются повреждение клеточной мембраны и связанное с ним нарушение биохимических процессов, баланса ионов. Роль усилителя патологических процессов могут играть неспецифические воздействия, возникающие в ходе болезни (образующиеся кислородные радикалы, действие оксида азота и др.). Ранее нами было показано, что многие неврологические заболевания у детей связаны с врожденной вирусной инфекцией [7].

В данной работе исследовались биохимические механизмы противовирусного действия крема с фоскарнетом, содержащего фосфонмуравьиную кислоту (ФМК).

Материалы и методы

В доклинических исследованиях изучали влияние противовирусного крема с фоскарнетом на активность АТФаз и ионный баланс плазмы у 19 детей с патологией нервной системы — органические поражения ЦНС, перинатальная энцефалопатия, различные формы детского церебрального паралича (ДЦП). Крем наносили раз в сутки в течение 2,5 — 4 недель на воротниковую зону и пораженные конечности. В качестве сравнения обследованы 30 детей того же возраста без каких-либо неврологических нарушений.

Активность хронической вирусной инфекции в динамике лечения детей оценивали в баллах на основании морфометрического анализа результатов реакции иммунофлюоресценции — морфометрический показатель активности (МПА) вирусной инфекции [6].

При биохимических исследованиях изучалось состояние мембран эритроцитов: активность ион-транспортирующих ферментов (АТФаз), интенсивность перекисного окисления липидов, количество свободного (не связанного с белками) магния в эритроцитах. Определялись также содержание тиреотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, триглицеридов и ионов магния, кальция, фосфора в плазме крови.

Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, плазму отделяли центрифугированием. Эритроциты дважды промывали охлажденным 0,85% раствором NaCl, осажденные эритроциты суспензировали в среде, содержащей гистидин, сахарозу и альбумин, и хранили в холодильнике не более 2-3 дней, хотя активность исследуемых ферментов сохранялась до 7 дней. Об активности ферментов судили по приросту неорганического фосфата в среде инкубации в отсутствии или в присутствии уабаина, угнетающего Na+, К+- АТФазу. По разности показателей рассчитывалась активность Na+, К+-АТФазы. Содержание фосфора в плазме и среде инкубации определяли по методу Лоури-Лопеца, триглицеридов, ионов магния и кальция – с помощью стандартных наборов реактивов фирмы «Ла Хема». Количество тиреоидных гормонов в плазме определяли радиоиммунологическим методом, интенсивность перекисного окисления липидов – по методу И.А.Волчегорского с соавт. [3].

В эксперименте, проведенном на эритроцитах доноров-добровольцев, исследовалось влияние вируса Коксаки А-18 на активность ион-транспортируюших АТФаз. Одновременно изучалось воздействие ФМК на активность этих ферментов.

Исследования проведены в пяти группах. 1-я группа (контроль). В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов, вводили рабочую среду (применяемую для разведения вируса), физиологический раствор (используемый для разведения ФМК), инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. 2-я группа. В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов, добавляли 50 цитопатических доз вируса Коксаки А-18, физиологический раствор. 3-я группа. В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов вводили 50 цитопатических доз вируса Коксаки А-18, инкубировали 10 мин, затем вносили 0,5% раствор ФМК. 4-я группа. В пробирку с эритроцитами вносили сначала раствор ФМК, а затем, после предварительной инкубации, вирус. 5-я группа. Изучалось влияние 0,5% раствора ФМК на эритроциты. Все пробирки инкубировали 50 мин при 37°С. Затем отбирали пробы для определения активности АТФаз. Реакцию останавливали добавлением ледяной 50% трихлоруксускной кислоты, одновременно инактивируя вирус.

Результаты исследований

Смешанная вирусная инфекция выявлена у 100% обследованных. Суммарный МПА вирусной инфекции у больных с ДЦП был 13,18, что более чем в 3 раза превышало таковой у здоровых детей (Р<0,01). У большинства пациентов была выявлена энтеровирусная инфекция в ассоциации с вирусами или кори, или краснухи, или гриппа, или герпеса простого.

Установлено, что при указанной патологии нервной системы нарушен баланс двухвалентных ионов кальция и магния. У большинства больных отмечалась гипокальциемия, часто сопровождавшаяся гипомагниемией. Установлено, что у детей с ДЦП снижена активность Na+, К+-АТФазы почти в 2 раза по сравнению с группой условно здоровых. Обнаружено повышение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембране эритроцитов. После лечения достоверно снижался суммарный МПА вирусной инфекции, главным образом за счет снижения активности репликации вирусов Коксаки А, полиомиелита и гриппа (табл. 1).

Одновременно достоверно повысились изначально низкое содержание кальция в плазме крови (до нормальных величин) и активность Na+, К+-АТФазы в эритроцитах (в 2,3 раза). Отмечена тенденция к снижению повышенного содержания трийодтиронина и тироксина и увеличению активности Ca++,Mg++-АТФазы. Остальные биохимические параметры существенно не менялись (табл. 2). Общее самочувствие детей несколько улучшалось.

Таблица 1. Морфологический показатель активности вирусной инфекции до и после лечения кремом с фоскарнетом.

Таблица 2. Биохимические показатели крови до и после лечения кремом с фоскарнетом

Таблица 3. Показатели влияния вируса Коксаки А-18 и ФМК на состоянии мембраны эритроцитов в группах экспериментальных исследований

При корреляционном анализе в группе детей до лечения выявлена средняя отрицательная корреляция между содержанием вторичных продуктов ПОЛ в плазме и активностью энтеровирусной инфекции. Такой же уровень корреляции установлен между содержанием кальция в плазме крови больных и МПА вирусов полиомиелита, кори, гриппа. Определенная взаимосвязь выявлена между активностью Са++, Мg++-АТФазы и МПА вирусов краснухи (r= — 0,41), кори (r= -0,42), Энтеро 68-71 (r= -0,66). Корреляция между активностью Na+, К+-АТФазы и МПА вирусов гриппа была отрицательной (r= -0,54).

После лечения, одновременно со снижением активности вирусной инфекции, исчезла корреляционная зависимость и появилась отрицательная корреляция между МПА вирусов полиомиелита, Коксаки В и активностью Na+, К+-АТФазы (r= -0,41) и (r= -0,45) соответственно. Показатель корреляционной связи между содержанием кальция в плазме и МПА вирусов полиомиелита несколько снизился (r= -0,51), исчезла корреляция с МПА репликации вирусов кори и осталась неизмененной взаимосвязь с МПА репликации вирусов гриппа. Суммарный МПА вирусной инфекции коррелировал (r= -0,74) с содержанием свободного магния в эритроцитах.

Однако спустя месяц после окончания лечения повторное вирусологическое обследование показало, что у детей с наиболее высокими начальными показателями вирусурии суммарный МПА ненамного отличался от такового до начала лечения. Было решено провести повторный курс лечения, увеличив длительность применения крема до 40 дней и добавив в конце лечения тимоген (капли в нос), с целью повышения общего иммунитета. После второго курса лечения суммарный МПА вирусной инфекции заметно уменьшился. Отмечено достоверное снижение активности вирусной инфекции, а также показателей репликации вирусов Коксаки А, полиомиелита и гриппа С. Очевидно, больным могут помочь повторные курсы (по 40 дней) применения противовирусного крема в комплексе с иммуномодулятором – тимогеном. Побочных явлений при применении крема с фоскарнетом не было.

Исследование влияния вируса Коксаки А-18 и ФМК на мембраны эритроцитов (в эксперименте) показало, что введение вирусов в среду инкубации приводит к заметному повышению активности Na+, К+-АТФазы. Активность Са++, Mg++-АТФазы не изменялась (табл. 3). ФМК, добавленная к среде инкубации (как до введения вируса, так и после), предупреждала повышение активности Na+, К+-АТФазы. Активность Са++ , Mg++-АТФазы при этом снижалась, если ФМК прибавляли до введения вируса (Р<0,05). Добавление к суспензии эритроцитов только ФМК приводило к некоторому торможению активности Са++, Mg++-АТФазы, активность Na+,-K+-AT-Фазы при этом увеличивалась (Р<0,05). Повышение активности Na+,-K+-AT-Фазы было менее выраженным, чем при добавлении только вируса. Содержание общих липидов и фосфолипидов в мембранах эритроцитов во всех группах изменялось незначительно. Добавление вируса вызывало увеличение содержания в эритроцитах магния, не связанного с белками. Аналогичное действие оказывала ФМК в отсутствии вируса. Если ФМК добавлялась до или после введения вируса, то отмечалась только некоторая тенденция к повышению содержание внутриклеточного магния.

Во всех группах, кроме второй, выявлялась выраженная положительная корреляционная зависимость активности исследуемых ферментов (r=+0,845). Введение вируса разрушало эту связь. Добавление ФМК после вируса вновь приводило к появлению этой корреляции, но она была значительно менее выраженной (r=+0,402).

Обсуждение результатов

Патогенные факторы, вызывающие повреждения нервной системы и нарушения ее деятельности, могут быть как экзогенной, так и эндогенной природы. К экзогенным факторам относятся агенты внешней среды, в том числе вирусы (полиомиелита, бешенства, гриппа и др.).

Вирусы нарушают синтез клеточных макромолекул. Вирус репродуцируется, используя клеточные системы синтеза и аккумуляции энергии, и, в конечном итоге, вызывает гибель клетки-хозяина. Но взаимодействие двух клеточных геномов может быть персистентным, когда вирус, размножаясь в клетках, не вызывает их гибели. Между клетками вируса и хозяина как бы устанавливается равновесие, не исключающее множественные нарушения, происходящие в тканях. Изменяется мембранный потенциал клетки, нарушается работа ионных каналов, повышается вход кальция в клетку [5]. Многие возбудители приобретают значение патогенных агентов в повреждении барьерных механизмов защиты, в том числе гематоэнцефалического барьера.

Известно, что глубокие, прогрессирующие изменения функций при поражениях головного мозга являются не только результатом физиологических сдвигов или перестройки нейродинамики определенных структур головного мозга, но и выражением их биохимических свойств [2]. Возникающие функциональные нарушения в центральной нервной системе выражаются в гиперактивации нейронов, обусловленной повышенным поступлением ионов натрия и кальция в клетку. Одновременно (из-за энергодефицита) значительно снижается активность Nа+, К+- и Са++, Mg++-АТФаз, что согласуется с нашими данными. Нами установлено, что у больных с указанной неврологической патологией нарушен баланс двухвалентных ионов кальция и магния: так, у большей части больных отмечается гипокальциемия, часто сопровождающаяся и гипомагниемией. В то же время примерно в 1/5 случаев наблюдалась гиперкальциемия при нормальном или сниженном содержании магния в плазме крови. После лечения одновременно со снижением активности вирусной инфекции достоверно возрастали содержание кальция в плазме крови (до нормальных величин) и активность Na+,-K+-AT-Фазы в эритроцитах (в 2,3 раза). Видимо, это связано не только с противовирусным действием ФМК, входящей в состав крема, но и с влиянием ксидифона (второго активного компонента крема), который, как известно, является регулятором баланса двухвалентных ионов. Отмечена тенденция к снижению изначально повышенных трийодтиронина и тироксина и повышению активности Са++, Mg++-ATФaзы. Параллельно в мембранах эритроцитов увеличивался индекс окисленности с одновременным снижением содержания диеновых конъюгатов, что может свидетельствовать о торможении процессов перекисного окисления липидов, но эти изменения не были статистически значимыми (возможно, из-за относительно небольшого времени применения крема).

Выявленная в эксперименте «аналогичность» действия вируса и ФМК позволяет предположить, что ФМК занимает вирусные рецепторы и/или аналогичные им структуры. Это особенно заметно на примере исследований в 3-й и 4-й группах. Активность Na+, K+-ATФазы, содержание магния в эритроцитах этих групп не отличались от контроля.

Повышение содержания фосфолипидов на 12,4% в обоих случаях можно, очевидно, объяснить встраиванием ФМК в мембрану или фосфорилированием мембранных липидов именно в ответ на введение вируса. Ничего подобного не наблюдалось при введении только ФМК. Судя по тому, что в 5-й группе активность Na+, K+-ATФазы увеличивалась параллельно с содержанием внутриклеточного магния, можно предположить, что ФМК обладает, как и ксидифон, свойствами хелатора, увеличивает доступность ионов магния для фермента.

Таким образом, нами установлено, что фосфонмуравьиная кислота, являющаяся одним из действующих компонентов крема с фоскарнетом, обладает противовирусным действием.

В результате лечения противовирусным кремом с фоскарнетом отмечены достоверное снижение активности вирусной инфекции, нормализация биохимических параметров.

Использование крема с фоскарнетом в комплексном лечении неврологических нарушений, связанных с хронической формой смешанной вирусной инфекции, несложно в применении, экономично и эффективно.

Литература

1. Агол В.И.Взаимодействие вируса и клетки // Молек. биол. вирусов. – М.: Наука, 1971. –  с. 190 — 408.
2. Букринская А.Г., Жданов В.М.Молекулярные основы патогенности вирусов. – М.: Медицина. – 1991. – 255 с.
3. Вапчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшии P.M.// Вопр. мед. химии. – 1989. – № 1. –  с. 127-131
4. Каблукова Е.К.Изменения клеточных мембран при острых респираторных вирусных заболеваниях у детей и эффективность препаратов мембраностабилизирующего действия: Автореф. … дис. д-ра мед. наук. – М., 1991. – 41 с.
5. Лозовская Л. С., Баканов М.И., Васильева Е.М. и др.Взаимосвязь между активностью вирусной инфекции и биохимическими нарушениями в крови у детей с поражением нервной системы и детским церебральным параличом: Информ. письмо. – М., 1999. – 10 с.
6. Лозовская Л. С., Шищенко В.М., Хелленов Э.А. и др.Прогнозирование и дифференциальная диагностика врожденных вирусных инфекций. – М. – 1992. – 25 с.
7. Лозовская Л.С., Юрьева Э.А., Елагина И.Л., Богач В.В.// Материалы конгресса «Человек и лекарство».  – М., 1998. – с. 502-503. Pasternak С.A. Viruses as Toxins // Archives of Virology. – 1987. – Vol. 93. – p. 169-184

1. Введение

Во второй половине нашего столетия были сделаны существенные открытия в области минерального обмена и его эндокринной регуляции. Полученные новые знания о регуляции и нарушениях обмена кальция позволили понять патогенез различных клинических синдромов, обусловленных этими нарушениями. К таким синдромам относятся рахит, остеохондроз, остеопороз, особенно постменопаузальный с высоким риском переломов позвонков, висцеральные и скелетные формы гиперпаратиреоза, остеодистрофии, мочекаменная болезнь, атеросклероз, болезнь Фара с отложением кальция в мозгу, кальциноз, дерматомиозит и другие.

Кальций по природе является фосфатофилом и содержится в разных тканях, в частности в митохондриях клеток в виде фосфатных солей (гидроксиапатит кальция). Если апатиты являются наиболее малорастворимыми солями кальция, то соединения с неорганическими бисфосфатами (пирофосфатами) могут становиться в зависимости от условий нерастворимыми (в костях) или растворимыми (в мягких тканях), т.е. неорганические бисфосфаты являются естественными регуляторами обмена кальция в организме. При постепенном снижении активности многочисленных регуляторных механизмов с возрастом обмен кальция нарушается и нерастворимые соли кальция откладываются в мягких тканях. Возникает вопрос, является ли кожа исключением? Для ответа на этот вопрос было проведено исследование изменения содержания кальция в клетках различных слоев кожи в зависимости от возраста.

2. Роль кальция в организме и его естественная регуляция

Биологические функции кальция исключительно сложны и многообразны. Кальций выполняет структурную роль, образуя вместе с фосфором минеральную основу скелета – кристаллы гидроксиаппатита. В скелете находится 99% всего кальция и 85% всего фосфора, содержащихся в организме. Можно сказать, что из-за значительных запасов кальция в скелете он относится к макроэлементам, но на уровне цитоплазмы, где кальций участвует в процессах регуляции, его концентрация не превышает 10^-7 М, что позволяет причислить его к микроэлементам.

Особая роль кальция заключается в регуляции внутриклеточных процессов, развитие которых определяется изменениями внутриклеточной концентрации кальция:

• двигательная активность клеток (мышечное сокращение, хемотаксис и др.);
• возбудимость клеток, способных к генерации электрического потенциала действия (мышечный тонус, биение сердца и др.);
• секреция гормонов и нейротрансмиттеров;
• фагоцитоз, пиноцитоз;
• репродукция клеток (митозы и др.).

Система внутриклеточной регуляции и «порогового действия» кальция способна функционировать только в том случае, если клетка располагает эффективными механизмами поддержания низкой концентрации кальция внутри клетки и огромного электрохимического градиента в плазматических мембранах. Поддерживание низкой концентрации кальция внутри клетки (10^-7 М) в среде с относительно высокой концентрацией кальция (10^-2 -10^-3 М) обеспечивается специальными биохимическими механизмами:

• способностью цитоплазматической мембраны оказывать сопротивление проникновению ионов кальция в цитоплазму;
• наличием в мембране специальной Са++АТФазы, которая активно выкачивает ионы кальция из клетки с использованием энергии АТФ;
• действием в мембране обменного транспорта (удалением ионов кальция из клетки в обмене на вход в клетку натрия);
• высокой кальций-связывающей способностью целого ряда внутриклеточных органелл (митохондрий), а также специфических кальций-связывающих белков, которые играют роль буфера, обеспечивающего низкую концентрацию свободных ионов кальция даже в случае повышенного потока кальция в клетку (кальмодулин — витамин Д, Са-связывающий белок, тропонин С и другие)¹.

Внутриклеточный гомеостаз кальция тесно взаимосвязан с его внеклеточным уровнем, который также тщательно контролируется в организме. Концентрация кальция в плазме составляет в среднем 2.5 мМ. Примерно 40% этого количества связано с белками и 10% связано с другими ионами, так что только примерно половина кальция сыворотки в норме представлена в виде ионизированного кальция концентрация которого тщательно контролируется не только внутри клетки, но и во внеклеточной среде. Постоянство концентрации ионизированного кальция объясняется важной ролью его во многих биологических процессах, в основном в трех органах-мишенях: тонкой кишке, костях, почках. В костях от уровня ионизированного кальция зависят процессы резорбции и ремоделирования кости (остеокласты)². Перемещение кальция контролируется тремя гормонами: паратиреоидным гормоном (ПТГ), гормональной формой витамина Д-1,25(ОН)₂Д₃ – кальцитриолом и кальцитонином, продуцируемым щитовидной железой. Все три гормона напрямую регулируют концентрацию кальция в крови с помощью механизма обратной связи. Из всех трех гормонов наиболее важную роль играет паратгормон, который повышает уровень кальция в крови, действуя на все три органа мишени. Метаболиты витамина Д также участвуют в регуляции минерализации костной ткани. Кальцитонин – подавляет деструкцию кости. Эта его способность используется в терапии заболеваний с повышенной резорбцией костей – таких? как болезнь Педжета, остеопороз и другие. Гормон секретируется в ответ на высокую концентрацию кальция в крови (положительная обратная связь).

3. Патологии кальциевого обмена

Патогенетические механизмы нарушения обмена кальция можно условно разделить на две группы: эндокринные и энергозависимые. К первой группе относятся состояния, обусловленные нарушением функции паращитовидных желез, играющих роль в регуляции уровня кальция во внеклеточной жидкости. Для паратгормона органами-мишенями являются костная ткань и почки. Вторым важнейшим регулятором обмена кальция является гормон щитовидной железы кальцитонин, поддерживающий внутриклеточный гомеостаз кальция³. Но самое непосредственное участие в обмене кальция в клетках кожи принимают эстрогены и витамин Д. Со снижением выработки эстрогенов у женщин после менопаузы быстро стареет кожа и возникают серьезные проблемы с обменом кальция в костях. С другой стороны, ограничение воздействия УФ лучей на кожу с возрастом снижает накопление в коже витамина Д, который образуется путем фото- биогенеза, происходящего в коже под влиянием УФ лучей. Витамин Д, кроме того обеспечивает устойчивость кожи к УФ лучам. Гормональная форма витамина Д — 1.25 дигидроксихолекальциферол (кальцитриол) стимулирует всасывание кальция и фосфатов в кишечнике и реабсорбцию их в почках, стимулирует ремоделирование костной ткани, транспорт кальция через мембраны клеток, дифференцировку клеток, развитие иммунной системы. Помимо гормонов, регулирующих обмен кальция (I группа факторов), большое значение в его регуляции имеет вторая группа факторов, вырабатываемых в клетках в результате трансформации АТФ. К этой группе факторов относятся неорганические поли- и бисфосфаты, являющиеся продуктами нормального энергетического обмена в клетках. С возрастом значительно падает продукция АТФ и, как следствие, снижается образование поли- и бисфосфатов, что приводит к нарушениям кальциевого обмена⁴.

4. Патологические состояния кожи, вызванные отложением солей кальция

С целью изучения характера накопления солей кальция (в основном фосфатов) в коже в зависимости от возраста нами были исследованы гистологические образцы кожи передней поверхности бедра у 8 людей различного возраста: 4 года, 9 лет, 12 лет, 30 лет, 50 лет, 60 лет, 65 лет, 70 лет. У детей образцы кожи были взяты попутно, при диагностической биопсии скелетных мышц. Выбор места для биопсии кожи обусловлен практическим отсутствием воздействия внешней среды (УФ лучи, обветривание) и косметических средств. Для оценки характера накопления солей кальция в коже использовался метод гистохимической окраски по Косса. Фиксация биопсийного материала проводилось в крепком спирте с последующим приготовлением срезов из парафиновых блоков. Окраска срезов осуществлялась с помощью 5% азотнокислого серебра в течении 60 минут на свету с дальнейшей обработкой 5% раствором гипосульфита, промывкой и заключением в парафин. Анализ отложения солей кальция, окрашенных в черный цвет, проводился с помощью светового микроскопа. Оценивалась интенсивность и распространенность отложения солей кальция в клетках кожи (Рис. 1, 2, 3).

Рис.1. Кожа ребенка 12 лет. Определяются микроконгломераты солей кальция в малом количестве в основном в области базального (росткового) слоя эпидермиса. Окраска по Косса, ув. 40х.

Рис.2. Кожа женщины 50 лет. Определяется значительное количество микроконгломератов солей кальция в области базального (росткового) слоя эпидермиса. Окраска по Косса, ув. 40х.

Рис.3. Кожа женщины 70 лет. Определяется резкое увеличение микроконгломератов солей кальция в области базального (росткового) слоя эпидермиса. Окраска по Косса, ув. 40х.

Результаты анализа показали, что для кожи детей было характерно малое количество микроконгломератов солей кальция. Гистологические препараты характеризовались наличием небольшого количества диффузных пылевидных включений, в основном, в базальном слое эпидермиса. У лиц более старшего возраста как количество, так и размеры микроконгломератов солей кальция в коже повышались. Наибольшая степень их накопления отмечалась в базальном слое эпидермиса 65- и 70-ти летних людей. Помимо накопления в базальном слое, выявлялись грубые микроконгломераты солей кальция в соединительных тканях сосочкового и сетчатого слоев кожи. На рис. 4 показано нарастание количества кальциевых депозитов в коже с учетом характера отложений их в клетке. На рис. 5 представлена суммарная оценка в баллах интенсивности заполнения кальциевыми солями клеток кожи человека в зависимости от возраста. При расчете баллов учитывалась доля и степень заполнения клеток ростковой зоны кальциевыми отложениями.

Таким образом, морфологически показано, что с возрастом повышается степень накопления солей кальция в коже людей, максимальные отложения кальция обнаруживаются у лиц пожилого возраста, а отложение солей кальция преимущественно в клетках росткового слоя эпидермиса вносит свой вклад в процесс старения кожи, усиливающийся с возрастом.

5. Способы искусственного регулирования обмена кальция в клетках кожи

Представленные данные являлись обоснованием целесообразности включения в состав косметических кремов соединений, регулирующих обмен кальция в клетках кожи как дополнительного средства для профилактики ее старения. Наилучший эффект среди различных хелатирующих соединений способных образовывать высокоустойчивые соединения с кальцием, выявлен при использовании бисфосфонатов в виде натрий-калиевой соли^5,6.

Это соединение является синтетическим аналогом неорганического бисфосфата, преимущества которого по сравнению с естественным регулятором клеточного обмена кальция заключаются в его устойчивости к спонтанному и ферментативному гидролизу. В организме человека нет ферментов разрушающих данный бисфосфонат, что позволяет получить регулирующий эффект на обмен кальция при применении небольших доз препарата. При исследовании фармакокинетики препарата, введенного через кожу, показано, что он всасывается через неповрежденную кожу значительно лучше, чем из желудочно-кишечного тракта (3-5% по сравнению с 0.5-1.0%, соответственно). Кроме того, выявлено, что препарат поступает в кровь и выводится с мочой в течении 36-48 часов. Сохранение терапевтической концентрации препарата в течении 24-36 часов при чрезкожном введении обеспечивает пролонгированный лечебный эффект, в отличие от перорального способа введения, при котором в течение 3-5 -го часа создается пик концентрации в крови, а к 10 — 12-му часу после однократного приема препарат практически отсутствует в крови (моче)⁷.

Кальцийрегулирующий эффект бисфосфоната на кожу подтвержден нами в аутоэксперименте на биопсии кожи 2 женщин (40 и 60 лет), у которых на кожу бедра с одной стороны наносился крем, содержащий 0.5% препарата – 1 раз в день в течение 10 дней. В качестве контроля исследовалась кожа бедра другой ноги. В результате показано, что в коже без применения крема имеются отложения кальция. В одном случае — во всех клетках в виде единичных отложений в апикальной области клеток ростковой зоны (40 лет), что равно 1 баллу, а в другом (60 лет) – 80% клеток имеют отложения солей кальция в виде единичных депозитов в апикальной части ростковой зоны и 40% клеток – в виде циркулярных отложений, что равно 2.4 балла. В коже бедра обоих женщин после применения крема не обнаружено отложений солей кальция в клетках ростковой зоны (Рис. 6а и 6б). Отсутствие отложений солей кальция после лечения в клетках зон роста эпидермиса подтверждает положительный эффект препарата как профилактического средства кальцификации клеток росткового слоя кожи. При окраске биопсийных срезов на ксидифон (1% сернокислый кобальт в щелочной среде) показано, что препарат накапливается именно в клетках росткового (базального) слоя эпидермиса, которые наиболее часто подвергаются кальцификации.

Рис 6. Кожа женщины 40 лет до (а) и после (б) применения крема РЕФАРМ (окраска по Косса на кальций, ув. 40х).

Таким образом, кожа с возрастом теряет способность к регенерации и, как следствие, эластичность, не только в результате изменения ее органических составных частей, но и, очевидно, в связи с нарастающим накоплением в клетках росткового слоя нерастворимых солей кальция.

6. Изучение клинической эффективности косметических кремов, содержащих ксидифон

Применение кремов, содержащих бисфосфонат оказывает лечебный и профилактический эффект, предупреждая отложения кальция в клетках кожи, что в сочетании с профилактическим действием питательной основы крема позволило предположить усиление омолаживающего влияния косметических средств. В этой связи данная часть работы посвящена экспериментально-клиническому изучению биологической активности кремов, производимых Институтом фармацевтических реактивов «РЕФАРМ».В эксперименте было проведено:

1. Гистологическое исследование биоптатов кожи белых крыс после 30 аппликаций.
2. Изучение влияния кремов на состояние защитной функции кожи лабораторных животных с помощью метода определения времени нейтрализации щелочи по методу Бургхарта.
3. Клиническая оценка состояния функциональных показателей кожи под воздействием представленных кремов включала в себя:
   • Изучение влагоудерживающей способности кожи;
   • Исследование состояния липидного обмена кожи;
   • Исследование эластичности кожи;
   • Изучение профиля кожи (ширины и глубины морщин).

Были получены следующие результаты:

1. При гистологическом изучении препаратов кожи животных, подвергавшихся обработке кремами РЕФАРМ, было выявлено их влияние на водно-электролитный и белковый обмены в коже, проявляющийся в усилении гидратантных свойств кожи.
2. Исследование влияние кремов на состояние защитной функции кожи показало, что в 1 группе животных, т.е. у крыс, которым наносился крем, восстановление исходного времени нейтрализации щелочи кожей (6 минут) произошло через 2 дня. Через 3 дня этот показатель снизился и составил 4 мин., т.е. был отмечен пролонгирующий эффект препарата.
   Во 2 группе животных, т.е. у крыс, на кожу которых не наносили крем, восстановление исходного времени нейтрализации щелочи произошло лишь на 7-ой день после прекращения воздействия щелочи, т.е. практически в 2.5 раза медленнее, чем у крыс 2 группы.
   Таким образом, полученные результаты, свидетельствовали о выраженном положительном воздействии крема на состояние одной из главных функций кожи — защитной.
3. В клинических испытаниях приняли участие 20 волонтеров – клинически здоровых женщин без отягощенного аллергологического анамнеза в возрасте от 35 до 50 лет. У 11 пациенток была диагностирована комбинированная кожа лица, у 9-ти – сухая осложненная гиперкератозом. Клинически это проявилось в сухости кожных покровов, наличием сети мелких морщин. Крем наносили на предварительно очищенную кожу лица и тела ежедневно 2 раза в день в течение 3-х недель.

Изучение влияния кремов на влагоудерживающую способность кожи проводилось с помощью прибора «Влагомер», Россия. Через 20 минут после первой аппликации крема содержание влаги в коже повысилось в среднем на 67,3% по сравнению с исходным уровнем, через 2 часа этот показатель составил 51,5%, через 4 часа – 36,6%, после курсового применения на 15,6%.

Полученные данные свидетельствовали о положительном влиянии крема на водно-электролитный обмен в коже и выраженном гидратантном эффекте препарата.

При исследовании влияния кремов на эластические свойства кожи было констатировано, что показатель растяжения в результате курсового применения крема увеличился в среднем на 10.9% по сравнению с исходным.

При изучении профиля кожи (ширины и глубины морщин) с помощью прибора Теstеr Т-2000 было установлено, что в результате 3-х недельного использования крема было отмечено снижение зубца R_t на 5,09%, R_max – на 6.7%, R_z-d на 6.3 % по сравнению с исходным уровнем, т.е. было констатировано положительное влияние крема на показатели, характеризующие профиль кожи.

На основании анализа рецептуры и результатов проведенных исследований можно сделать заключение о том, что косметические кремы РЕФАРМ, в состав которых входит регулятор кальциевого обмена, являются эффективными косметическими средствами, применение которых оказывает выраженный гидратантный эффект, улучшает эластичность и тонус кожи, разглаживает сеть мелких морщин, улучшает защитную функцию кожи.

Данные косметические средства могут быть рекомендованы для применения в широкой косметологической практике с целью ухода за кожей тела в качестве эффективного средства профилактики и коррекции процессов старения кожи.

7. Литература

1. В.К. Бауман, «Биохимия и физиология витамина Д» Рига, Зинатые, 1989, 480с.
2. Fleisch, Bisphosphonates in bone disease, 1997, London, 184p.
3. Feldman, D., and Mallon, P.J. and Gross, C. (1996). Vitamin D: metabolism and action.In Marcus, R., Feldman, D. and Kelsey, J. (eds) Osteoporosis, pp.205-35. (San Diego: Academic Press).
4. Bushinsky, D.A. and Krieger, N.S. (1992). Integration of calcium metabolism in the adult. In Coe, F.L. and Favus, M.J. (eds.) Disorders of Bone and Mineral Metabolism, pp.417-32. (New York: Raven Press).
5. О.Г.Архипова, Э.А. Юрьева, Н.М. Дятлова,«Перспективы применения ксидифона», Ж. Всес. хим. общ. им. Д.И. Менделеева, 1984, XXIX, 3, с.76-80.
6. Т.А. Матковская, Н.П. Татарникова, и др. Пат. РФ RU 2124881 C1.
7. Э.А. Юрьева, И.П. Дунаева, Г.И. Кулакова «Эффективность ксидифона в зависимости от способа его применения», В сб.: Новый хелатирующий агент ксидифон. Фармакология, токсикология и терапия. Москва, 1990., с.62-70.

(Статья приведена с сокращениями. Полный текст опубликован в журнале: Косметика и медицина, 1999, № 5/6, с.71.)