Задать вопрос





О противовирусном действии крема с фоскарнетом

22 Мар 2017 г.

ВАСИЛЬЕВА Е.М., кандидат биологических наук
МАТКОВСКАЯ Т.А., кандидат химических наук
ЗУБКОВА И.В.
БАКАНОВ М.И., доктор медицинских наук
ЛОЗОВСКАЯ Л. С., доктор медицинских наук

 

Вирусы и их токсины оказывают повреждающее действие на центральную нервную систему. Поражение нервных клеток при вирусной инфекции может быть следствием не только репродукции вируса, но и результатом развития иммунопатологических реакций на поверхности клетки [2, 4, 8]. Имеется прямая зависимость между степенью повреждения клеточных мембран и тяжестью болезни. Полагают, что вирусная инфекция является пусковым механизмом патологического процесса [2]. Известно, что клетка может поражаться вирусом, даже если у нее нет комплементарных с ним рецепторов (например, вирусы полиомиелита, Коксаки) [1].

В последнее время особую актуальность приобрела проблема поиска противовирусных препаратов. Например, при миксовирусных и парамиксовирусных инфекциях эффективны амантадин, гуанидин, а также антибиотики актиномицин Д, пуромицин и др. [1]. Но антибиотики сами являются токсичными веществами. При моделировании на животных хронической формы Коксаки инфекции и поиске эффективных средств борьбы с ней нами было установлено противовирусное действие фосфонуксусной кислоты [7]. Существуют данные, что такие вещества, как азидотимидин, 2,3- дидезоксинуклеозиды и фосфонформиат, нарушают обратную транскрипцию онковирусов и вирусов иммунодефицита человека [2].

Важнейшими факторами, часто приводящими к гибели клетки, являются повреждение клеточной мембраны и связанное с ним нарушение биохимических процессов, баланса ионов. Роль усилителя патологических процессов могут играть неспецифические воздействия, возникающие в ходе болезни (образующиеся кислородные радикалы, действие оксида азота и др.). Ранее нами было показано, что многие неврологические заболевания у детей связаны с врожденной вирусной инфекцией [7].

В данной работе исследовались биохимические механизмы противовирусного действия крема с фоскарнетом, содержащего фосфонмуравьиную кислоту (ФМК).

 

Материалы и методы

В доклинических исследованиях изучали влияние противовирусного крема с фоскарнетом на активность АТФаз и ионный баланс плазмы у 19 детей с патологией нервной системы — органические поражения ЦНС, перинатальная энцефалопатия, различные формы детского церебрального паралича (ДЦП). Крем наносили раз в сутки в течение 2,5 — 4 недель на воротниковую зону и пораженные конечности. В качестве сравнения обследованы 30 детей того же возраста без каких-либо неврологических нарушений.

Активность хронической вирусной инфекции в динамике лечения детей оценивали в баллах на основании морфометрического анализа результатов реакции иммунофлюоресценции — морфометрический показатель активности (МПА) вирусной инфекции [6].

При биохимических исследованиях изучалось состояние мембран эритроцитов: активность ион-транспортирующих ферментов (АТФаз), интенсивность перекисного окисления липидов, количество свободного (не связанного с белками) магния в эритроцитах. Определялись также содержание тиреотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, триглицеридов и ионов магния, кальция, фосфора в плазме крови.

Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, плазму отделяли центрифугированием. Эритроциты дважды промывали охлажденным 0,85% раствором NaCl, осажденные эритроциты суспензировали в среде, содержащей гистидин, сахарозу и альбумин, и хранили в холодильнике не более 2-3 дней, хотя активность исследуемых ферментов сохранялась до 7 дней. Об активности ферментов судили по приросту неорганического фосфата в среде инкубации в отсутствии или в присутствии уабаина, угнетающего Na+, К+- АТФазу. По разности показателей рассчитывалась активность Na+, К+-АТФазы. Содержание фосфора в плазме и среде инкубации определяли по методу Лоури-Лопеца, триглицеридов, ионов магния и кальция – с помощью стандартных наборов реактивов фирмы «Ла Хема». Количество тиреоидных гормонов в плазме определяли радиоиммунологическим методом, интенсивность перекисного окисления липидов – по методу И.А.Волчегорского с соавт. [3].

В эксперименте, проведенном на эритроцитах доноров-добровольцев, исследовалось влияние вируса Коксаки А-18 на активность ион-транспортируюших АТФаз. Одновременно изучалось воздействие ФМК на активность этих ферментов.

Исследования проведены в пяти группах. 1-я группа (контроль). В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов, вводили рабочую среду (применяемую для разведения вируса), физиологический раствор (используемый для разведения ФМК), инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. 2-я группа. В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов, добавляли 50 цитопатических доз вируса Коксаки А-18, физиологический раствор. 3-я группа. В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов вводили 50 цитопатических доз вируса Коксаки А-18, инкубировали 10 мин, затем вносили 0,5% раствор ФМК. 4-я группа. В пробирку с эритроцитами вносили сначала раствор ФМК, а затем, после предварительной инкубации, вирус. 5-я группа. Изучалось влияние 0,5% раствора ФМК на эритроциты. Все пробирки инкубировали 50 мин при 37°С. Затем отбирали пробы для определения активности АТФаз. Реакцию останавливали добавлением ледяной 50% трихлоруксускной кислоты, одновременно инактивируя вирус.

 

Результаты исследований

Смешанная вирусная инфекция выявлена у 100% обследованных. Суммарный МПА вирусной инфекции у больных с ДЦП был 13,18, что более чем в 3 раза превышало таковой у здоровых детей (Р<0,01). У большинства пациентов была выявлена энтеровирусная инфекция в ассоциации с вирусами или кори, или краснухи, или гриппа, или герпеса простого.

Установлено, что при указанной патологии нервной системы нарушен баланс двухвалентных ионов кальция и магния. У большинства больных отмечалась гипокальциемия, часто сопровождавшаяся гипомагниемией. Установлено, что у детей с ДЦП снижена активность Na+, К+-АТФазы почти в 2 раза по сравнению с группой условно здоровых. Обнаружено повышение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембране эритроцитов. После лечения достоверно снижался суммарный МПА вирусной инфекции, главным образом за счет снижения активности репликации вирусов Коксаки А, полиомиелита и гриппа (табл. 1).

Одновременно достоверно повысились изначально низкое содержание кальция в плазме крови (до нормальных величин) и активность Na+, К+-АТФазы в эритроцитах (в 2,3 раза). Отмечена тенденция к снижению повышенного содержания трийодтиронина и тироксина и увеличению активности Ca++,Mg++-АТФазы. Остальные биохимические параметры существенно не менялись (табл. 2). Общее самочувствие детей несколько улучшалось.

 

Морфологический показатель активности вирусной инфекции до и после лечения кремом с фоскарнетом.

Таблица 1. Морфологический показатель активности вирусной инфекции до и после лечения кремом с фоскарнетом.

 

Биохимические показатели крови до и после лечения кремом с фоскарнетом

Таблица 2. Биохимические показатели крови до и после лечения кремом с фоскарнетом

 

Показатели влияния вируса Коксаки А-18 и ФМК на состоянии мембраны эритроцитов в группах экспериментальных исследований

Таблица 3. Показатели влияния вируса Коксаки А-18 и ФМК на состоянии мембраны эритроцитов в группах экспериментальных исследований

 

При корреляционном анализе в группе детей до лечения выявлена средняя отрицательная корреляция между содержанием вторичных продуктов ПОЛ в плазме и активностью энтеровирусной инфекции. Такой же уровень корреляции установлен между содержанием кальция в плазме крови больных и МПА вирусов полиомиелита, кори, гриппа. Определенная взаимосвязь выявлена между активностью Са++, Мg++-АТФазы и МПА вирусов краснухи (r= — 0,41), кори (r= -0,42), Энтеро 68-71 (r= -0,66). Корреляция между активностью Na+, К+-АТФазы и МПА вирусов гриппа была отрицательной (r= -0,54).

После лечения, одновременно со снижением активности вирусной инфекции, исчезла корреляционная зависимость и появилась отрицательная корреляция между МПА вирусов полиомиелита, Коксаки В и активностью Na+, К+-АТФазы (r= -0,41) и (r= -0,45) соответственно. Показатель корреляционной связи между содержанием кальция в плазме и МПА вирусов полиомиелита несколько снизился (r= -0,51), исчезла корреляция с МПА репликации вирусов кори и осталась неизмененной взаимосвязь с МПА репликации вирусов гриппа. Суммарный МПА вирусной инфекции коррелировал (r= -0,74) с содержанием свободного магния в эритроцитах.

Однако спустя месяц после окончания лечения повторное вирусологическое обследование показало, что у детей с наиболее высокими начальными показателями вирусурии суммарный МПА ненамного отличался от такового до начала лечения. Было решено провести повторный курс лечения, увеличив длительность применения крема до 40 дней и добавив в конце лечения тимоген (капли в нос), с целью повышения общего иммунитета. После второго курса лечения суммарный МПА вирусной инфекции заметно уменьшился. Отмечено достоверное снижение активности вирусной инфекции, а также показателей репликации вирусов Коксаки А, полиомиелита и гриппа С. Очевидно, больным могут помочь повторные курсы (по 40 дней) применения противовирусного крема в комплексе с иммуномодулятором – тимогеном. Побочных явлений при применении крема с фоскарнетом не было.

Исследование влияния вируса Коксаки А-18 и ФМК на мембраны эритроцитов (в эксперименте) показало, что введение вирусов в среду инкубации приводит к заметному повышению активности Na+, К+-АТФазы. Активность Са++, Mg++-АТФазы не изменялась (табл. 3). ФМК, добавленная к среде инкубации (как до введения вируса, так и после), предупреждала повышение активности Na+, К+-АТФазы. Активность Са++ , Mg++-АТФазы при этом снижалась, если ФМК прибавляли до введения вируса (Р<0,05). Добавление к суспензии эритроцитов только ФМК приводило к некоторому торможению активности Са++, Mg++-АТФазы, активность Na+,-K+-AT-Фазы при этом увеличивалась (Р<0,05). Повышение активности Na+,-K+-AT-Фазы было менее выраженным, чем при добавлении только вируса. Содержание общих липидов и фосфолипидов в мембранах эритроцитов во всех группах изменялось незначительно. Добавление вируса вызывало увеличение содержания в эритроцитах магния, не связанного с белками. Аналогичное действие оказывала ФМК в отсутствии вируса. Если ФМК добавлялась до или после введения вируса, то отмечалась только некоторая тенденция к повышению содержание внутриклеточного магния.

Во всех группах, кроме второй, выявлялась выраженная положительная корреляционная зависимость активности исследуемых ферментов (r=+0,845). Введение вируса разрушало эту связь. Добавление ФМК после вируса вновь приводило к появлению этой корреляции, но она была значительно менее выраженной (r=+0,402).

 

Обсуждение результатов

Патогенные факторы, вызывающие повреждения нервной системы и нарушения ее деятельности, могут быть как экзогенной, так и эндогенной природы. К экзогенным факторам относятся агенты внешней среды, в том числе вирусы (полиомиелита, бешенства, гриппа и др.).

Вирусы нарушают синтез клеточных макромолекул. Вирус репродуцируется, используя клеточные системы синтеза и аккумуляции энергии, и, в конечном итоге, вызывает гибель клетки-хозяина. Но взаимодействие двух клеточных геномов может быть персистентным, когда вирус, размножаясь в клетках, не вызывает их гибели. Между клетками вируса и хозяина как бы устанавливается равновесие, не исключающее множественные нарушения, происходящие в тканях. Изменяется мембранный потенциал клетки, нарушается работа ионных каналов, повышается вход кальция в клетку [5]. Многие возбудители приобретают значение патогенных агентов в повреждении барьерных механизмов защиты, в том числе гематоэнцефалического барьера.

Известно, что глубокие, прогрессирующие изменения функций при поражениях головного мозга являются не только результатом физиологических сдвигов или перестройки нейродинамики определенных структур головного мозга, но и выражением их биохимических свойств [2]. Возникающие функциональные нарушения в центральной нервной системе выражаются в гиперактивации нейронов, обусловленной повышенным поступлением ионов натрия и кальция в клетку. Одновременно (из-за энергодефицита) значительно снижается активность Nа+, К+- и Са++, Mg++-АТФаз, что согласуется с нашими данными. Нами установлено, что у больных с указанной неврологической патологией нарушен баланс двухвалентных ионов кальция и магния: так, у большей части больных отмечается гипокальциемия, часто сопровождающаяся и гипомагниемией. В то же время примерно в 1/5 случаев наблюдалась гиперкальциемия при нормальном или сниженном содержании магния в плазме крови. После лечения одновременно со снижением активности вирусной инфекции достоверно возрастали содержание кальция в плазме крови (до нормальных величин) и активность Na+,-K+-AT-Фазы в эритроцитах (в 2,3 раза). Видимо, это связано не только с противовирусным действием ФМК, входящей в состав крема, но и с влиянием ксидифона (второго активного компонента крема), который, как известно, является регулятором баланса двухвалентных ионов. Отмечена тенденция к снижению изначально повышенных трийодтиронина и тироксина и повышению активности Са++, Mg++-ATФaзы. Параллельно в мембранах эритроцитов увеличивался индекс окисленности с одновременным снижением содержания диеновых конъюгатов, что может свидетельствовать о торможении процессов перекисного окисления липидов, но эти изменения не были статистически значимыми (возможно, из-за относительно небольшого времени применения крема).

Выявленная в эксперименте «аналогичность» действия вируса и ФМК позволяет предположить, что ФМК занимает вирусные рецепторы и/или аналогичные им структуры. Это особенно заметно на примере исследований в 3-й и 4-й группах. Активность Na+, K+-ATФазы, содержание магния в эритроцитах этих групп не отличались от контроля.

Повышение содержания фосфолипидов на 12,4% в обоих случаях можно, очевидно, объяснить встраиванием ФМК в мембрану или фосфорилированием мембранных липидов именно в ответ на введение вируса. Ничего подобного не наблюдалось при введении только ФМК. Судя по тому, что в 5-й группе активность Na+, K+-ATФазы увеличивалась параллельно с содержанием внутриклеточного магния, можно предположить, что ФМК обладает, как и ксидифон, свойствами хелатора, увеличивает доступность ионов магния для фермента.

Таким образом, нами установлено, что фосфонмуравьиная кислота, являющаяся одним из действующих компонентов крема с фоскарнетом, обладает противовирусным действием.

В результате лечения противовирусным кремом с фоскарнетом отмечены достоверное снижение активности вирусной инфекции, нормализация биохимических параметров.

Использование крема с фоскарнетом в комплексном лечении неврологических нарушений, связанных с хронической формой смешанной вирусной инфекции, несложно в применении, экономично и эффективно.

 

Литература

  1. Агол В.И.Взаимодействие вируса и клетки // Молек. биол. вирусов. – М.: Наука, 1971. –  с. 190 — 408.
  2. Букринская А.Г., Жданов В.М.Молекулярные основы патогенности вирусов. – М.: Медицина. – 1991. – 255 с.
  3. Вапчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшии P.M.// Вопр. мед. химии. – 1989. – № 1. –  с. 127-131
  4. Каблукова Е.К.Изменения клеточных мембран при острых респираторных вирусных заболеваниях у детей и эффективность препаратов мембраностабилизирующего действия: Автореф. … дис. д-ра мед. наук. – М., 1991. – 41 с.
  5. Лозовская Л. С., Баканов М.И., Васильева Е.М. и др.Взаимосвязь между активностью вирусной инфекции и биохимическими нарушениями в крови у детей с поражением нервной системы и детским церебральным параличом: Информ. письмо. – М., 1999. – 10 с.
  6. Лозовская Л. С., Шищенко В.М., Хелленов Э.А. и др.Прогнозирование и дифференциальная диагностика врожденных вирусных инфекций. – М. – 1992. – 25 с.
  7. Лозовская Л.С., Юрьева Э.А., Елагина И.Л., Богач В.В.// Материалы конгресса «Человек и лекарство».  – М., 1998. – с. 502-503. Pasternak С.A. Viruses as Toxins // Archives of Virology. – 1987. – Vol. 93. – p. 169-184

Антицеллюлитный крем. Каков принцип его действия?

12 Апр 2017 г.

Антицеллюлитные кремы относятся к серии косметических и лечебно-профилактических средств для предупреждения и устранения целлюлита...


Какие препараты используются для лечения остеохондроза

19 Мар 2017 г.

Остеохондроз – заболевание позвоночника, характерной особенностью которого является дегенеративно-дистрофическое поражение межпозвонковых дисков, а затем и...


Как беречь колени. Лечим отложение солей в коленных суставах

24 Мар 2017 г.

«Отложение солей» в коленных суставах – бытовое название их артроза (гонартроза). Гонартроз (артроз коленного...


О противовирусном действии крема с фоскарнетом

22 Мар 2017 г.

В данной работе исследовались биохимические механизмы противовирусного действия крема с фоскарнетом, содержащего фосфонмуравьиную кислоту.


Бег как образ жизни, творчество и любимый бизнес. Евгения Румянцева

15 Сен 2017 г.

Бег сегодня находится на пике популярности. Он не только объединяет вокруг себя много интересных...


Внимание! Мошенники!

20 Мар 2018 г.

Компания «Рефарм» предупреждает покупателей о появлении поддельных сайтов, которые выдают себя за нашу компанию!


Каким образом кальций приводит к появлению морщин

17 Апр 2017 г.

Кальций – это один из важнейших макроэлементов человеческого организма. По общему количеству содержания он...


Спортивная серия кремов РЕФАРМ в магазине ТРИСПОРТ

22 Мар 2018 г.

Теперь популярные средства компании «Рефарм» из профессиональной линейки кремов для спортсменов и любителей активного...