Нарушение гомеостаза кальция в клетках кожи как фактор ее старения

ООО «Институт фармацевтических реактивов РЕФАРМ», к.х.н. Матковская Т.А., к.т.н. Столяров Ю.Ю.
НИИ Педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, д.м.н.  Юрьева Э.А. 
Московский Институт Красоты, к.м.н. Маяцкая Т.В.

 

1. Введение

Во второй половине нашего столетия были сделаны существенные открытия в области минерального обмена и его эндокринной регуляции. Полученные новые знания о регуляции и нарушениях обмена кальция позволили понять патогенез различных клинических синдромов, обусловленных этими нарушениями. К таким синдромам относятся рахит, остеохондроз, остеопороз, особенно постменопаузальный с высоким риском переломов позвонков, висцеральные и скелетные формы гиперпаратиреоза, остеодистрофии, мочекаменная болезнь, атеросклероз, болезнь Фара с отложением кальция в мозгу, кальциноз, дерматомиозит и другие.

Кальций по природе является фосфатофилом и содержится в разных тканях, в частности в митохондриях клеток в виде фосфатных солей (гидроксиапатит кальция). Если апатиты являются наиболее малорастворимыми солями кальция, то соединения с неорганическими бисфосфатами (пирофосфатами) могут становиться в зависимости от условий нерастворимыми (в костях) или растворимыми (в мягких тканях), т.е. неорганические бисфосфаты являются естественными регуляторами обмена кальция в организме. При постепенном снижении активности многочисленных регуляторных механизмов с возрастом обмен кальция нарушается и нерастворимые соли кальция откладываются в мягких тканях. Возникает вопрос, является ли кожа исключением? Для ответа на этот вопрос было проведено исследование изменения содержания кальция в клетках различных слоев кожи в зависимости от возраста.

 

2. Роль кальция в организме и его естественная регуляция

Биологические функции кальция исключительно сложны и многообразны. Кальций выполняет структурную роль, образуя вместе с фосфором минеральную основу скелета – кристаллы гидроксиаппатита. В скелете находится 99% всего кальция и 85% всего фосфора, содержащихся в организме. Можно сказать, что из-за значительных запасов кальция в скелете он относится к макроэлементам, но на уровне цитоплазмы, где кальций участвует в процессах регуляции, его концентрация не превышает 10^-7 М, что позволяет причислить его к микроэлементам.

Особая роль кальция заключается в регуляции внутриклеточных процессов, развитие которых определяется изменениями внутриклеточной концентрации кальция:

• двигательная активность клеток (мышечное сокращение, хемотаксис и др.);
• возбудимость клеток, способных к генерации электрического потенциала действия (мышечный тонус, биение сердца и др.);
• секреция гормонов и нейротрансмиттеров;
• фагоцитоз, пиноцитоз;
• репродукция клеток (митозы и др.).

 

Система внутриклеточной регуляции и «порогового действия» кальция способна функционировать только в том случае, если клетка располагает эффективными механизмами поддержания низкой концентрации кальция внутри клетки и огромного электрохимического градиента в плазматических мембранах. Поддерживание низкой концентрации кальция внутри клетки (10^-7 М) в среде с относительно высокой концентрацией кальция (10^-2 -10^-3 М) обеспечивается специальными биохимическими механизмами:

• способностью цитоплазматической мембраны оказывать сопротивление проникновению ионов кальция в цитоплазму;
• наличием в мембране специальной Са++АТФазы, которая активно выкачивает ионы кальция из клетки с использованием энергии АТФ;
• действием в мембране обменного транспорта (удалением ионов кальция из клетки в обмене на вход в клетку натрия);
• высокой кальций-связывающей способностью целого ряда внутриклеточных органелл (митохондрий), а также специфических кальций-связывающих белков, которые играют роль буфера, обеспечивающего низкую концентрацию свободных ионов кальция даже в случае повышенного потока кальция в клетку (кальмодулин — витамин Д, Са-связывающий белок, тропонин С и другие)¹.

Внутриклеточный гомеостаз кальция тесно взаимосвязан с его внеклеточным уровнем, который также тщательно контролируется в организме. Концентрация кальция в плазме составляет в среднем 2.5 мМ. Примерно 40% этого количества связано с белками и 10% связано с другими ионами, так что только примерно половина кальция сыворотки в норме представлена в виде ионизированного кальция концентрация которого тщательно контролируется не только внутри клетки, но и во внеклеточной среде. Постоянство концентрации ионизированного кальция объясняется важной ролью его во многих биологических процессах, в основном в трех органах-мишенях: тонкой кишке, костях, почках. В костях от уровня ионизированного кальция зависят процессы резорбции и ремоделирования кости (остеокласты)². Перемещение кальция контролируется тремя гормонами: паратиреоидным гормоном (ПТГ), гормональной формой витамина Д-1,25(ОН)₂Д₃ – кальцитриолом и кальцитонином, продуцируемым щитовидной железой. Все три гормона напрямую регулируют концентрацию кальция в крови с помощью механизма обратной связи. Из всех трех гормонов наиболее важную роль играет паратгормон, который повышает уровень кальция в крови, действуя на все три органа мишени. Метаболиты витамина Д также участвуют в регуляции минерализации костной ткани. Кальцитонин – подавляет деструкцию кости. Эта его способность используется в терапии заболеваний с повышенной резорбцией костей – таких? как болезнь Педжета, остеопороз и другие. Гормон секретируется в ответ на высокую концентрацию кальция в крови (положительная обратная связь).

 

3. Патологии кальциевого обмена

Патогенетические механизмы нарушения обмена кальция можно условно разделить на две группы: эндокринные и энергозависимые. К первой группе относятся состояния, обусловленные нарушением функции паращитовидных желез, играющих роль в регуляции уровня кальция во внеклеточной жидкости. Для паратгормона органами-мишенями являются костная ткань и почки. Вторым важнейшим регулятором обмена кальция является гормон щитовидной железы кальцитонин, поддерживающий внутриклеточный гомеостаз кальция³. Но самое непосредственное участие в обмене кальция в клетках кожи принимают эстрогены и витамин Д. Со снижением выработки эстрогенов у женщин после менопаузы быстро стареет кожа и возникают серьезные проблемы с обменом кальция в костях. С другой стороны, ограничение воздействия УФ лучей на кожу с возрастом снижает накопление в коже витамина Д, который образуется путем фото- биогенеза, происходящего в коже под влиянием УФ лучей. Витамин Д, кроме того обеспечивает устойчивость кожи к УФ лучам. Гормональная форма витамина Д — 1.25 дигидроксихолекальциферол (кальцитриол) стимулирует всасывание кальция и фосфатов в кишечнике и реабсорбцию их в почках, стимулирует ремоделирование костной ткани, транспорт кальция через мембраны клеток, дифференцировку клеток, развитие иммунной системы. Помимо гормонов, регулирующих обмен кальция (I группа факторов), большое значение в его регуляции имеет вторая группа факторов, вырабатываемых в клетках в результате трансформации АТФ. К этой группе факторов относятся неорганические поли- и бисфосфаты, являющиеся продуктами нормального энергетического обмена в клетках. С возрастом значительно падает продукция АТФ и, как следствие, снижается образование поли- и бисфосфатов, что приводит к нарушениям кальциевого обмена⁴.

 

4. Патологические состояния кожи, вызванные отложением солей кальция

С целью изучения характера накопления солей кальция (в основном фосфатов) в коже в зависимости от возраста нами были исследованы гистологические образцы кожи передней поверхности бедра у 8 людей различного возраста: 4 года, 9 лет, 12 лет, 30 лет, 50 лет, 60 лет, 65 лет, 70 лет. У детей образцы кожи были взяты попутно, при диагностической биопсии скелетных мышц. Выбор места для биопсии кожи обусловлен практическим отсутствием воздействия внешней среды (УФ лучи, обветривание) и косметических средств. Для оценки характера накопления солей кальция в коже использовался метод гистохимической окраски по Косса. Фиксация биопсийного материала проводилось в крепком спирте с последующим приготовлением срезов из парафиновых блоков. Окраска срезов осуществлялась с помощью 5% азотнокислого серебра в течении 60 минут на свету с дальнейшей обработкой 5% раствором гипосульфита, промывкой и заключением в парафин. Анализ отложения солей кальция, окрашенных в черный цвет, проводился с помощью светового микроскопа. Оценивалась интенсивность и распространенность отложения солей кальция в клетках кожи (Рис. 1, 2, 3).

 

Рис.1. Кожа ребенка 12 лет. Определяются микроконгломераты солей кальция в малом количестве в основном в области базального (росткового) слоя эпидермиса. Окраска по Косса, ув. 40х.

 

Рис.2. Кожа женщины 50 лет. Определяется значительное количество микроконгломератов солей кальция в области базального (росткового) слоя эпидермиса. Окраска по Косса, ув. 40х.

 

 

Рис.3. Кожа женщины 70 лет. Определяется резкое увеличение микроконгломератов солей кальция в области базального (росткового) слоя эпидермиса. Окраска по Косса, ув. 40х.

 

Результаты анализа показали, что для кожи детей было характерно малое количество микроконгломератов солей кальция. Гистологические препараты характеризовались наличием небольшого количества диффузных пылевидных включений, в основном, в базальном слое эпидермиса. У лиц более старшего возраста как количество, так и размеры микроконгломератов солей кальция в коже повышались. Наибольшая степень их накопления отмечалась в базальном слое эпидермиса 65- и 70-ти летних людей. Помимо накопления в базальном слое, выявлялись грубые микроконгломераты солей кальция в соединительных тканях сосочкового и сетчатого слоев кожи. На рис. 4 показано нарастание количества кальциевых депозитов в коже с учетом характера отложений их в клетке. На рис. 5 представлена суммарная оценка в баллах интенсивности заполнения кальциевыми солями клеток кожи человека в зависимости от возраста. При расчете баллов учитывалась доля и степень заполнения клеток ростковой зоны кальциевыми отложениями.

 

 

Таким образом, морфологически показано, что с возрастом повышается степень накопления солей кальция в коже людей, максимальные отложения кальция обнаруживаются у лиц пожилого возраста, а отложение солей кальция преимущественно в клетках росткового слоя эпидермиса вносит свой вклад в процесс старения кожи, усиливающийся с возрастом.

 

5. Способы искусственного регулирования обмена кальция в клетках кожи

Представленные данные являлись обоснованием целесообразности включения в состав косметических кремов соединений, регулирующих обмен кальция в клетках кожи как дополнительного средства для профилактики ее старения. Наилучший эффект среди различных хелатирующих соединений способных образовывать высокоустойчивые соединения с кальцием, выявлен при использовании бисфосфонатов в виде натрий-калиевой соли^5,6.

Это соединение является синтетическим аналогом неорганического бисфосфата, преимущества которого по сравнению с естественным регулятором клеточного обмена кальция заключаются в его устойчивости к спонтанному и ферментативному гидролизу. В организме человека нет ферментов разрушающих данный бисфосфонат, что позволяет получить регулирующий эффект на обмен кальция при применении небольших доз препарата. При исследовании фармакокинетики препарата, введенного через кожу, показано, что он всасывается через неповрежденную кожу значительно лучше, чем из желудочно-кишечного тракта (3-5% по сравнению с 0.5-1.0%, соответственно). Кроме того, выявлено, что препарат поступает в кровь и выводится с мочой в течении 36-48 часов. Сохранение терапевтической концентрации препарата в течении 24-36 часов при чрезкожном введении обеспечивает пролонгированный лечебный эффект, в отличие от перорального способа введения, при котором в течение 3-5 -го часа создается пик концентрации в крови, а к 10 — 12-му часу после однократного приема препарат практически отсутствует в крови (моче)⁷.

Кальцийрегулирующий эффект бисфосфоната на кожу подтвержден нами в аутоэксперименте на биопсии кожи 2 женщин (40 и 60 лет), у которых на кожу бедра с одной стороны наносился крем, содержащий 0.5% препарата – 1 раз в день в течение 10 дней. В качестве контроля исследовалась кожа бедра другой ноги. В результате показано, что в коже без применения крема имеются отложения кальция. В одном случае — во всех клетках в виде единичных отложений в апикальной области клеток ростковой зоны (40 лет), что равно 1 баллу, а в другом (60 лет) – 80% клеток имеют отложения солей кальция в виде единичных депозитов в апикальной части ростковой зоны и 40% клеток – в виде циркулярных отложений, что равно 2.4 балла. В коже бедра обоих женщин после применения крема не обнаружено отложений солей кальция в клетках ростковой зоны (Рис. 6а и 6б). Отсутствие отложений солей кальция после лечения в клетках зон роста эпидермиса подтверждает положительный эффект препарата как профилактического средства кальцификации клеток росткового слоя кожи. При окраске биопсийных срезов на ксидифон (1% сернокислый кобальт в щелочной среде) показано, что препарат накапливается именно в клетках росткового (базального) слоя эпидермиса, которые наиболее часто подвергаются кальцификации.

 

Рис 6. Кожа женщины 40 лет до (а) и после (б) применения крема РЕФАРМ (окраска по Косса на кальций, ув. 40х).

 

Таким образом, кожа с возрастом теряет способность к регенерации и, как следствие, эластичность, не только в результате изменения ее органических составных частей, но и, очевидно, в связи с нарастающим накоплением в клетках росткового слоя нерастворимых солей кальция.

 

6. Изучение клинической эффективности косметических кремов, содержащих ксидифон

Применение кремов, содержащих бисфосфонат оказывает лечебный и профилактический эффект, предупреждая отложения кальция в клетках кожи, что в сочетании с профилактическим действием питательной основы крема позволило предположить усиление омолаживающего влияния косметических средств. В этой связи данная часть работы посвящена экспериментально-клиническому изучению биологической активности кремов, производимых Институтом фармацевтических реактивов «РЕФАРМ».В эксперименте было проведено:

1. Гистологическое исследование биоптатов кожи белых крыс после 30 аппликаций.
2. Изучение влияния кремов на состояние защитной функции кожи лабораторных животных с помощью метода определения времени нейтрализации щелочи по методу Бургхарта.
3. Клиническая оценка состояния функциональных показателей кожи под воздействием представленных кремов включала в себя:
   • Изучение влагоудерживающей способности кожи;
   • Исследование состояния липидного обмена кожи;
   • Исследование эластичности кожи;
   • Изучение профиля кожи (ширины и глубины морщин).

Были получены следующие результаты:

1. При гистологическом изучении препаратов кожи животных, подвергавшихся обработке кремами РЕФАРМ, было выявлено их влияние на водно-электролитный и белковый обмены в коже, проявляющийся в усилении гидратантных свойств кожи.
2. Исследование влияние кремов на состояние защитной функции кожи показало, что в 1 группе животных, т.е. у крыс, которым наносился крем, восстановление исходного времени нейтрализации щелочи кожей (6 минут) произошло через 2 дня. Через 3 дня этот показатель снизился и составил 4 мин., т.е. был отмечен пролонгирующий эффект препарата.
   Во 2 группе животных, т.е. у крыс, на кожу которых не наносили крем, восстановление исходного времени нейтрализации щелочи произошло лишь на 7-ой день после прекращения воздействия щелочи, т.е. практически в 2.5 раза медленнее, чем у крыс 2 группы.
   Таким образом, полученные результаты, свидетельствовали о выраженном положительном воздействии крема на состояние одной из главных функций кожи — защитной.
3. В клинических испытаниях приняли участие 20 волонтеров – клинически здоровых женщин без отягощенного аллергологического анамнеза в возрасте от 35 до 50 лет. У 11 пациенток была диагностирована комбинированная кожа лица, у 9-ти – сухая осложненная гиперкератозом. Клинически это проявилось в сухости кожных покровов, наличием сети мелких морщин. Крем наносили на предварительно очищенную кожу лица и тела ежедневно 2 раза в день в течение 3-х недель.

 

Изучение влияния кремов на влагоудерживающую способность кожи проводилось с помощью прибора «Влагомер», Россия. Через 20 минут после первой аппликации крема содержание влаги в коже повысилось в среднем на 67,3% по сравнению с исходным уровнем, через 2 часа этот показатель составил 51,5%, через 4 часа – 36,6%, после курсового применения на 15,6%.

Полученные данные свидетельствовали о положительном влиянии крема на водно-электролитный обмен в коже и выраженном гидратантном эффекте препарата.

При исследовании влияния кремов на эластические свойства кожи было констатировано, что показатель растяжения в результате курсового применения крема увеличился в среднем на 10.9% по сравнению с исходным.

При изучении профиля кожи (ширины и глубины морщин) с помощью прибора Теstеr Т-2000 было установлено, что в результате 3-х недельного использования крема было отмечено снижение зубца R_t на 5,09%, R_max – на 6.7%, R_z-d на 6.3 % по сравнению с исходным уровнем, т.е. было констатировано положительное влияние крема на показатели, характеризующие профиль кожи.

На основании анализа рецептуры и результатов проведенных исследований можно сделать заключение о том, что косметические кремы РЕФАРМ, в состав которых входит регулятор кальциевого обмена, являются эффективными косметическими средствами, применение которых оказывает выраженный гидратантный эффект, улучшает эластичность и тонус кожи, разглаживает сеть мелких морщин, улучшает защитную функцию кожи.

Данные косметические средства могут быть рекомендованы для применения в широкой косметологической практике с целью ухода за кожей тела в качестве эффективного средства профилактики и коррекции процессов старения кожи.

 

7. Литература

1. В.К. Бауман, «Биохимия и физиология витамина Д» Рига, Зинатые, 1989, 480с.
2. Fleisch, Bisphosphonates in bone disease, 1997, London, 184p.
3. Feldman, D., and Mallon, P.J. and Gross, C. (1996). Vitamin D: metabolism and action.In Marcus, R., Feldman, D. and Kelsey, J. (eds) Osteoporosis, pp.205-35. (San Diego: Academic Press).
4. Bushinsky, D.A. and Krieger, N.S. (1992). Integration of calcium metabolism in the adult. In Coe, F.L. and Favus, M.J. (eds.) Disorders of Bone and Mineral Metabolism, pp.417-32. (New York: Raven Press).
5. О.Г.Архипова, Э.А. Юрьева, Н.М. Дятлова,«Перспективы применения ксидифона», Ж. Всес. хим. общ. им. Д.И. Менделеева, 1984, XXIX, 3, с.76-80.
6. Т.А. Матковская, Н.П. Татарникова, и др. Пат. РФ RU 2124881 C1.
7. Э.А. Юрьева, И.П. Дунаева, Г.И. Кулакова «Эффективность ксидифона в зависимости от способа его применения», В сб.: Новый хелатирующий агент ксидифон. Фармакология, токсикология и терапия. Москва, 1990., с.62-70.

 

(Статья приведена с сокращениями. Полный текст опубликован в журнале: Косметика и медицина, 1999, № 5/6, с.71.)