О противовирусном действии крема с фоскарнетом

ВАСИЛЬЕВА Е.М., кандидат биологических наук
МАТКОВСКАЯ Т.А., кандидат химических наук
ЗУБКОВА И.В.
БАКАНОВ М.И., доктор медицинских наук
ЛОЗОВСКАЯ Л. С., доктор медицинских наук

 

Вирусы и их токсины оказывают повреждающее действие на центральную нервную систему. Поражение нервных клеток при вирусной инфекции может быть следствием не только репродукции вируса, но и результатом развития иммунопатологических реакций на поверхности клетки [2, 4, 8]. Имеется прямая зависимость между степенью повреждения клеточных мембран и тяжестью болезни. Полагают, что вирусная инфекция является пусковым механизмом патологического процесса [2]. Известно, что клетка может поражаться вирусом, даже если у нее нет комплементарных с ним рецепторов (например, вирусы полиомиелита, Коксаки) [1].

В последнее время особую актуальность приобрела проблема поиска противовирусных препаратов. Например, при миксовирусных и парамиксовирусных инфекциях эффективны амантадин, гуанидин, а также антибиотики актиномицин Д, пуромицин и др. [1]. Но антибиотики сами являются токсичными веществами. При моделировании на животных хронической формы Коксаки инфекции и поиске эффективных средств борьбы с ней нами было установлено противовирусное действие фосфонуксусной кислоты [7]. Существуют данные, что такие вещества, как азидотимидин, 2,3- дидезоксинуклеозиды и фосфонформиат, нарушают обратную транскрипцию онковирусов и вирусов иммунодефицита человека [2].

Важнейшими факторами, часто приводящими к гибели клетки, являются повреждение клеточной мембраны и связанное с ним нарушение биохимических процессов, баланса ионов. Роль усилителя патологических процессов могут играть неспецифические воздействия, возникающие в ходе болезни (образующиеся кислородные радикалы, действие оксида азота и др.). Ранее нами было показано, что многие неврологические заболевания у детей связаны с врожденной вирусной инфекцией [7].

В данной работе исследовались биохимические механизмы противовирусного действия крема с фоскарнетом, содержащего фосфонмуравьиную кислоту (ФМК).

 

Материалы и методы

В доклинических исследованиях изучали влияние противовирусного крема с фоскарнетом на активность АТФаз и ионный баланс плазмы у 19 детей с патологией нервной системы — органические поражения ЦНС, перинатальная энцефалопатия, различные формы детского церебрального паралича (ДЦП). Крем наносили раз в сутки в течение 2,5 — 4 недель на воротниковую зону и пораженные конечности. В качестве сравнения обследованы 30 детей того же возраста без каких-либо неврологических нарушений.

Активность хронической вирусной инфекции в динамике лечения детей оценивали в баллах на основании морфометрического анализа результатов реакции иммунофлюоресценции — морфометрический показатель активности (МПА) вирусной инфекции [6].

При биохимических исследованиях изучалось состояние мембран эритроцитов: активность ион-транспортирующих ферментов (АТФаз), интенсивность перекисного окисления липидов, количество свободного (не связанного с белками) магния в эритроцитах. Определялись также содержание тиреотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, триглицеридов и ионов магния, кальция, фосфора в плазме крови.

Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, плазму отделяли центрифугированием. Эритроциты дважды промывали охлажденным 0,85% раствором NaCl, осажденные эритроциты суспензировали в среде, содержащей гистидин, сахарозу и альбумин, и хранили в холодильнике не более 2-3 дней, хотя активность исследуемых ферментов сохранялась до 7 дней. Об активности ферментов судили по приросту неорганического фосфата в среде инкубации в отсутствии или в присутствии уабаина, угнетающего Na+, К+- АТФазу. По разности показателей рассчитывалась активность Na+, К+-АТФазы. Содержание фосфора в плазме и среде инкубации определяли по методу Лоури-Лопеца, триглицеридов, ионов магния и кальция – с помощью стандартных наборов реактивов фирмы «Ла Хема». Количество тиреоидных гормонов в плазме определяли радиоиммунологическим методом, интенсивность перекисного окисления липидов – по методу И.А.Волчегорского с соавт. [3].

В эксперименте, проведенном на эритроцитах доноров-добровольцев, исследовалось влияние вируса Коксаки А-18 на активность ион-транспортируюших АТФаз. Одновременно изучалось воздействие ФМК на активность этих ферментов.

Исследования проведены в пяти группах. 1-я группа (контроль). В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов, вводили рабочую среду (применяемую для разведения вируса), физиологический раствор (используемый для разведения ФМК), инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. 2-я группа. В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов, добавляли 50 цитопатических доз вируса Коксаки А-18, физиологический раствор. 3-я группа. В пробирку, содержащую суспензию эритроцитов вводили 50 цитопатических доз вируса Коксаки А-18, инкубировали 10 мин, затем вносили 0,5% раствор ФМК. 4-я группа. В пробирку с эритроцитами вносили сначала раствор ФМК, а затем, после предварительной инкубации, вирус. 5-я группа. Изучалось влияние 0,5% раствора ФМК на эритроциты. Все пробирки инкубировали 50 мин при 37°С. Затем отбирали пробы для определения активности АТФаз. Реакцию останавливали добавлением ледяной 50% трихлоруксускной кислоты, одновременно инактивируя вирус.

 

Результаты исследований

Смешанная вирусная инфекция выявлена у 100% обследованных. Суммарный МПА вирусной инфекции у больных с ДЦП был 13,18, что более чем в 3 раза превышало таковой у здоровых детей (Р<0,01). У большинства пациентов была выявлена энтеровирусная инфекция в ассоциации с вирусами или кори, или краснухи, или гриппа, или герпеса простого.

Установлено, что при указанной патологии нервной системы нарушен баланс двухвалентных ионов кальция и магния. У большинства больных отмечалась гипокальциемия, часто сопровождавшаяся гипомагниемией. Установлено, что у детей с ДЦП снижена активность Na+, К+-АТФазы почти в 2 раза по сравнению с группой условно здоровых. Обнаружено повышение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембране эритроцитов. После лечения достоверно снижался суммарный МПА вирусной инфекции, главным образом за счет снижения активности репликации вирусов Коксаки А, полиомиелита и гриппа (табл. 1).

Одновременно достоверно повысились изначально низкое содержание кальция в плазме крови (до нормальных величин) и активность Na+, К+-АТФазы в эритроцитах (в 2,3 раза). Отмечена тенденция к снижению повышенного содержания трийодтиронина и тироксина и увеличению активности Ca++,Mg++-АТФазы. Остальные биохимические параметры существенно не менялись (табл. 2). Общее самочувствие детей несколько улучшалось.

 

Таблица 1. Морфологический показатель активности вирусной инфекции до и после лечения кремом с фоскарнетом.

 

Таблица 2. Биохимические показатели крови до и после лечения кремом с фоскарнетом

 

Таблица 3. Показатели влияния вируса Коксаки А-18 и ФМК на состоянии мембраны эритроцитов в группах экспериментальных исследований

 

При корреляционном анализе в группе детей до лечения выявлена средняя отрицательная корреляция между содержанием вторичных продуктов ПОЛ в плазме и активностью энтеровирусной инфекции. Такой же уровень корреляции установлен между содержанием кальция в плазме крови больных и МПА вирусов полиомиелита, кори, гриппа. Определенная взаимосвязь выявлена между активностью Са++, Мg++-АТФазы и МПА вирусов краснухи (r= — 0,41), кори (r= -0,42), Энтеро 68-71 (r= -0,66). Корреляция между активностью Na+, К+-АТФазы и МПА вирусов гриппа была отрицательной (r= -0,54).

После лечения, одновременно со снижением активности вирусной инфекции, исчезла корреляционная зависимость и появилась отрицательная корреляция между МПА вирусов полиомиелита, Коксаки В и активностью Na+, К+-АТФазы (r= -0,41) и (r= -0,45) соответственно. Показатель корреляционной связи между содержанием кальция в плазме и МПА вирусов полиомиелита несколько снизился (r= -0,51), исчезла корреляция с МПА репликации вирусов кори и осталась неизмененной взаимосвязь с МПА репликации вирусов гриппа. Суммарный МПА вирусной инфекции коррелировал (r= -0,74) с содержанием свободного магния в эритроцитах.

Однако спустя месяц после окончания лечения повторное вирусологическое обследование показало, что у детей с наиболее высокими начальными показателями вирусурии суммарный МПА ненамного отличался от такового до начала лечения. Было решено провести повторный курс лечения, увеличив длительность применения крема до 40 дней и добавив в конце лечения тимоген (капли в нос), с целью повышения общего иммунитета. После второго курса лечения суммарный МПА вирусной инфекции заметно уменьшился. Отмечено достоверное снижение активности вирусной инфекции, а также показателей репликации вирусов Коксаки А, полиомиелита и гриппа С. Очевидно, больным могут помочь повторные курсы (по 40 дней) применения противовирусного крема в комплексе с иммуномодулятором – тимогеном. Побочных явлений при применении крема с фоскарнетом не было.

Исследование влияния вируса Коксаки А-18 и ФМК на мембраны эритроцитов (в эксперименте) показало, что введение вирусов в среду инкубации приводит к заметному повышению активности Na+, К+-АТФазы. Активность Са++, Mg++-АТФазы не изменялась (табл. 3). ФМК, добавленная к среде инкубации (как до введения вируса, так и после), предупреждала повышение активности Na+, К+-АТФазы. Активность Са++ , Mg++-АТФазы при этом снижалась, если ФМК прибавляли до введения вируса (Р<0,05). Добавление к суспензии эритроцитов только ФМК приводило к некоторому торможению активности Са++, Mg++-АТФазы, активность Na+,-K+-AT-Фазы при этом увеличивалась (Р<0,05). Повышение активности Na+,-K+-AT-Фазы было менее выраженным, чем при добавлении только вируса. Содержание общих липидов и фосфолипидов в мембранах эритроцитов во всех группах изменялось незначительно. Добавление вируса вызывало увеличение содержания в эритроцитах магния, не связанного с белками. Аналогичное действие оказывала ФМК в отсутствии вируса. Если ФМК добавлялась до или после введения вируса, то отмечалась только некоторая тенденция к повышению содержание внутриклеточного магния.

Во всех группах, кроме второй, выявлялась выраженная положительная корреляционная зависимость активности исследуемых ферментов (r=+0,845). Введение вируса разрушало эту связь. Добавление ФМК после вируса вновь приводило к появлению этой корреляции, но она была значительно менее выраженной (r=+0,402).

 

Обсуждение результатов

Патогенные факторы, вызывающие повреждения нервной системы и нарушения ее деятельности, могут быть как экзогенной, так и эндогенной природы. К экзогенным факторам относятся агенты внешней среды, в том числе вирусы (полиомиелита, бешенства, гриппа и др.).

Вирусы нарушают синтез клеточных макромолекул. Вирус репродуцируется, используя клеточные системы синтеза и аккумуляции энергии, и, в конечном итоге, вызывает гибель клетки-хозяина. Но взаимодействие двух клеточных геномов может быть персистентным, когда вирус, размножаясь в клетках, не вызывает их гибели. Между клетками вируса и хозяина как бы устанавливается равновесие, не исключающее множественные нарушения, происходящие в тканях. Изменяется мембранный потенциал клетки, нарушается работа ионных каналов, повышается вход кальция в клетку [5]. Многие возбудители приобретают значение патогенных агентов в повреждении барьерных механизмов защиты, в том числе гематоэнцефалического барьера.

Известно, что глубокие, прогрессирующие изменения функций при поражениях головного мозга являются не только результатом физиологических сдвигов или перестройки нейродинамики определенных структур головного мозга, но и выражением их биохимических свойств [2]. Возникающие функциональные нарушения в центральной нервной системе выражаются в гиперактивации нейронов, обусловленной повышенным поступлением ионов натрия и кальция в клетку. Одновременно (из-за энергодефицита) значительно снижается активность Nа+, К+- и Са++, Mg++-АТФаз, что согласуется с нашими данными. Нами установлено, что у больных с указанной неврологической патологией нарушен баланс двухвалентных ионов кальция и магния: так, у большей части больных отмечается гипокальциемия, часто сопровождающаяся и гипомагниемией. В то же время примерно в 1/5 случаев наблюдалась гиперкальциемия при нормальном или сниженном содержании магния в плазме крови. После лечения одновременно со снижением активности вирусной инфекции достоверно возрастали содержание кальция в плазме крови (до нормальных величин) и активность Na+,-K+-AT-Фазы в эритроцитах (в 2,3 раза). Видимо, это связано не только с противовирусным действием ФМК, входящей в состав крема, но и с влиянием ксидифона (второго активного компонента крема), который, как известно, является регулятором баланса двухвалентных ионов. Отмечена тенденция к снижению изначально повышенных трийодтиронина и тироксина и повышению активности Са++, Mg++-ATФaзы. Параллельно в мембранах эритроцитов увеличивался индекс окисленности с одновременным снижением содержания диеновых конъюгатов, что может свидетельствовать о торможении процессов перекисного окисления липидов, но эти изменения не были статистически значимыми (возможно, из-за относительно небольшого времени применения крема).

Выявленная в эксперименте «аналогичность» действия вируса и ФМК позволяет предположить, что ФМК занимает вирусные рецепторы и/или аналогичные им структуры. Это особенно заметно на примере исследований в 3-й и 4-й группах. Активность Na+, K+-ATФазы, содержание магния в эритроцитах этих групп не отличались от контроля.

Повышение содержания фосфолипидов на 12,4% в обоих случаях можно, очевидно, объяснить встраиванием ФМК в мембрану или фосфорилированием мембранных липидов именно в ответ на введение вируса. Ничего подобного не наблюдалось при введении только ФМК. Судя по тому, что в 5-й группе активность Na+, K+-ATФазы увеличивалась параллельно с содержанием внутриклеточного магния, можно предположить, что ФМК обладает, как и ксидифон, свойствами хелатора, увеличивает доступность ионов магния для фермента.

Таким образом, нами установлено, что фосфонмуравьиная кислота, являющаяся одним из действующих компонентов крема с фоскарнетом, обладает противовирусным действием.

В результате лечения противовирусным кремом с фоскарнетом отмечены достоверное снижение активности вирусной инфекции, нормализация биохимических параметров.

Использование крема с фоскарнетом в комплексном лечении неврологических нарушений, связанных с хронической формой смешанной вирусной инфекции, несложно в применении, экономично и эффективно.

 

Литература

1. Агол В.И.Взаимодействие вируса и клетки // Молек. биол. вирусов. – М.: Наука, 1971. –  с. 190 — 408.
2. Букринская А.Г., Жданов В.М.Молекулярные основы патогенности вирусов. – М.: Медицина. – 1991. – 255 с.
3. Вапчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшии P.M.// Вопр. мед. химии. – 1989. – № 1. –  с. 127-131
4. Каблукова Е.К.Изменения клеточных мембран при острых респираторных вирусных заболеваниях у детей и эффективность препаратов мембраностабилизирующего действия: Автореф. … дис. д-ра мед. наук. – М., 1991. – 41 с.
5. Лозовская Л. С., Баканов М.И., Васильева Е.М. и др.Взаимосвязь между активностью вирусной инфекции и биохимическими нарушениями в крови у детей с поражением нервной системы и детским церебральным параличом: Информ. письмо. – М., 1999. – 10 с.
6. Лозовская Л. С., Шищенко В.М., Хелленов Э.А. и др.Прогнозирование и дифференциальная диагностика врожденных вирусных инфекций. – М. – 1992. – 25 с.
7. Лозовская Л.С., Юрьева Э.А., Елагина И.Л., Богач В.В.// Материалы конгресса «Человек и лекарство».  – М., 1998. – с. 502-503. Pasternak С.A. Viruses as Toxins // Archives of Virology. – 1987. – Vol. 93. – p. 169-184